PRÁCTICA Nº 1: PRETRATAMIENTO DE SEMILLAS PARA SU USO EN LA PRODUCCIÓN DE PLANTA MICORRIZADA. Micorrización
Introducción
El establecimiento de micorrizas entre una especie vegetal concreta y un hongo determinado puede verse favorecida por las adecuadas condiciones de trabajo que pueden ser fácilmente controladas en el laboratorio. De este modo, y una vez testadas, aquellas asociaciones micorrícicas que resulten más efectivas o que se desarrollen con más facilidad podrán ser llevadas a cabo en el vivero.
Objetivos
El alumno será capaz de llevar a la práctica las técnicas de micorrización: obtención de semillas estériles y acondicionadas para su más rápida germinación, y dosificación del inóculo
Material
Agua destilada
Colador
H2O2 al 30 %
Jabón líquido concentrado
Semillas de Quercus sp. y Pinus sp.
Vaso de precipitados
Protocolo
Pinus
1. Mantener a remojo en agua corriente durante 12 horas
2. Agitar con agua y jabón durante 20 minutos
3. Lavar con agua corriente para aclarar
4. Sumergir en H2O2 al 30% y agitar durante 15 minutos
5. Lavar abundantemente con agua destilada
Quercus
1. Lavar con agua corriente
2. Sumergir en H2O2 al 1,5 % durante 5 minutos
3. Sumergir en lejía diluida 10 veces durante 5 minutos
4. Lavar abundantemente con agua destilada
Este tratamiento se realiza para eliminar la cubierta dura de las semillas o los frutos así como los inhibidores de la germinación que se acumulan en las cubiertas seminales, acelerando así su germinación. Se consigue además, esterilizar la superficie de las semillas.
Las semillas se siembran en contenedores pequeños para que germinen.
Cuando las plántulas tienen un mes se trasladan a los contenedores definitivos donde ya pueden ser inoculadas.
PRÁCTICA Nº 2. OBTENCIÓN DE INÓCULO ESPORAL Y VEGETATIVO. (INÓCULO VEGETATIVO ENCAPSULADO: PROCESO, PRODUCTO)
Introducción
Existen diversos tipos de inóculo y numerosas formas de aplicarlo que facilitan su manipulación, mejoran su viavilidad, su infectividad y su efectvidad. Los dos tipos básicos de inóculo son el esporal y el micelial.
Podemos señalar como principales ventajas del inóculo esporal el ser un método barato y sencillo de obtener, siendo por ello bastante utilizado, aunque tiene como inconvenientes: que ha de ser usado rápidamente, ya que las esporas van perdiendo viabilidad con el tiempo, y que no es un método totalmente efectivo. Algunas esporas pueden conservarse viables durante 2 ó 3 meses si se mantienen en frío< pero el tiempo que se pueden tener almacenadas puede variar mucho de unas especies a otras y siempre es escaso.
El inóculo vegetativo o micelial tiene la ventaja de ser más efectivo que el esporal en la colonización de raíces y además permite la producción de inóculo a gran escala de una única variedad fúngica, aunque por otro lado el equipamiento requerido suele ser costoso y se necesita personal cualificado para su preparación y manejo.
Objetivos
El alumno será capaz de llevar a la práctica las técnicas necesarias para la síntesis de micorrizas: obtención de inóculo esporal e inóculo micelial
Material y equipamiento necesario
Algodón hidrófobo
Agua destilada estéril
Bisturí
Carpóforos maduros
Morteros
Tela de algodón fina (200 µm de luz)
Turba+vermiculita
Vasos de precipitados (250 y 500 ml)
Varilla de plástico
Protocolo para la obtención de inóculo esporal:
La elaboración de inóculo esporal puede realizarse a partir de carpóforos frescos o secos. Básicamente consiste en preparar una solución de esporas o mezclarlas con otro agente transportados que facilite la manipulación de las esporas para la aplicación (arena, arcilla, ...).
1.- En fresco, se escogen los carpóforos de una especie concreta (son muy adecuados los carpóforos de aquellas especies que contienen un gran número de esporas), y con ayuda de una cuchilla se separa el himenio y se deposita en un mortero.
2.- Se trituran los himenios hasta obtener una pasta homogénea
3.- La pasta resultante se vierte en un vaso de precipitados, se le añade agua destilada y se agita bien para homogeneizar la mezcla. La proporción debe ser de 3 partes de agua por 1 de himenio machacado. Ej.: si la pasta conteniendo las esporas ocupa 1 ml, debemos añadirle 3 ml de agua destilada
4.- Esta mezcla se filtra a través de una tela de algodón fina para eliminar los restos de tejido fúngico y reservar sólo las esporas
5.- Una vez elaborado el inóculo esporal puede incorporarse al agua de riego, quedando así el sustrato de los contenedores impregnado de esporas que, al germinar, pueden infectar las raíces y formar micorrizas.
Trabajando con carpóforos secos, el proceso es el mismo con la particularidad de que es preciso evitar la pérdida de esporas triturando los carpóforos secos dentro de una bolsa y facilitar la homogeneización de solución mediante la adición de un agente humectante (las esporas son hidrófobas).
Para obtener buenos resultados hay que tener en cuenta la compatibilidad de la simbiosis y utilizar esporas de hongos que previamente se sepa que tienen capacidad de infectar a las plantas que nos interesa micorrizar, así como el tiempo de viabilidad de las esporas. Para conseguir una concentración determinada (que debe oscilar 10 5 - 10 7 esporas por ml) se cuenta el número de esporas de la solución madre utilizando una cámara de recuento (cámara de New Bauer). A partir de la solución madre, se obtiene la concentración requerida mediante dilución. La solución obtenida tras la dilución, está lista para usar como inóculo esporal.
